原代內(nèi)膜細胞培養(yǎng)體系是一個為體外生長的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳動物器官中的內(nèi)膜細胞設(shè)計的理想的完培方案。本體系是一個基于碳酸氫鹽的緩沖體系,可以在孵育的5%的CO2的氣體環(huán)境下維持一個圍繞pH7.2的酸堿緩沖體系。本體系是一個無菌的液體混合系統(tǒng),其中包含必須和非必須氨基酸、維生素、激素、生長因子、微量元素和一些其他的有機和無機化合物以及胎牛血清(10%)。本培養(yǎng)體系是基于固定配方配制的液態(tài)培養(yǎng)體系,可以為體外培養(yǎng)的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳動物器官中的內(nèi)膜細胞提供一個確定適宜的平衡營養(yǎng)環(huán)境,并且可以選擇性的促進內(nèi)膜細胞的擴增。
細胞貼壁障礙:
貼壁率低或漂浮
原因:
消化過度(胰酶濃度過高或時間過長)損傷細胞表面蛋白;
培養(yǎng)器皿未包被或包被不當,缺乏細胞外基質(zhì)支持;
血清濃度不足(<5%)或貼壁因子缺失;
操作溫度過低導致細胞收縮脫落。
解決:
改用低濃度胰酶(0.04%-0.05%)并嚴格控制消化時間;
使用膠原蛋白(0.1%)、明膠或纖連蛋白包被培養(yǎng)皿;
血清濃度提升至5%-10%(需根據(jù)細胞類型調(diào)整);
預(yù)熱培養(yǎng)基至37℃,操作環(huán)境維持25℃以上。
傳代后貼壁失敗:
原因:
傳代比例過大(如1:4以上),細胞密度過低無法分泌足夠基質(zhì);
殘留消化酶損傷或誘導凋亡。
解決:
控制傳代比例為1:2至1:3,接種后24小時內(nèi)靜置培養(yǎng);
中和胰酶(推薦無血清胰酶抑制劑)。